SARS-CoV-2 感染水貂模型

早在2020年4月，很多国家就发生了水貂养殖场内新冠病毒可能由感染新冠的员工引入养殖场，传给水貂的系列事件，经济损失惨重。病毒可在水貂之间传播，在水貂间传播的过程中发生突变，也可从水貂传给养殖场的其他动物。水貂还可能将病毒传播给水貂养殖场人员，以上数据都表明水貂对新冠病毒高度易感。构建新冠肺炎水貂模型，系统地研究新冠病毒感染水貂后的致病机制和生理病理学改变，为阐述临床病理机制，药物和疫苗评价，生物标志物筛选提供良好的动物模型。

1试验材料

1.1 病毒株

SARS-CoV-2（原2019-nCoV, HB-01），由中国疾控中心谭文杰教授提供，新型冠状病毒的全基因组序列可以在GISAID (BetaCoV / Wuhan /IVDC-HB-01 /2020|EPI_ISL_402119)获得，存放于中国微生物数据中心（登录号NMDC10013001，基因组登录号MDC60013002-01）。

1.2 试验动物

选择SPF 级6 周至 11月龄各段的ICR 与 C57 BL/ 6J，18-22 g，来自中国医学科学院医学实验动物研究所（IACUC 批准号：BLL20001）

2试验操作规程

2.1 人 hACE2转基因小鼠的制备

表达人 hACE2 基因的小鼠，由小鼠ACE2 启动子驱动，经 RT-PCR 和 Western blot 验证 hACE2 基因在小鼠肺组织内的表达（图3）[4]。

2.2 病毒传代

将新型冠状病毒接种到Vero细胞进行分离和储存。Vero细胞培养在DMEM（英潍捷基, 美国）添加10%胎牛血清，100 IU/ml 青霉素和100 μg/ml链霉素的培养基中，环境为37°C，5%CO2。新型冠状病毒的病毒滴度用标准的半数细胞感染率（a standard 50% tissue culture infection dose，TCID50）进行分析。

2.3 动物模型的感染方法

（1） 途径：滴鼻；

（2） 感染剂量：1× 105 TCID50 只；

（3） 感染体积：50 μl 只；

（4） 对照组：等体积 PBS。

2.4 动物模型分析

（1）症状观察：感染后，每天观察动物一般症状，记录体重。

（2）病毒载量：定时收集各组动物脏器，进行RNA抽提，利用RT-PCR技术，检测组织中病毒载量。RT-PCR所用的新型冠状病毒引物如下：上游为5’-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3’ 下游为5’-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’。

（3）病毒分离：肺组织在 DMEM 溶液中研磨制备成匀浆，离心分离上清后，接种于Vero细胞分离病毒并观察细胞病变。

（4）病理学观察 用新鲜的组织制备冰冻切片，将组织固定在冷冻剂上，肺脏组织（10um）切好后在 100% 丙酮内固定 15 分钟，之后用 HE染色，镜下观察。

（5）免疫荧光染色肺脏切片用PBS洗三遍，用固定液充分固定，用封闭液室温封闭 1h，一抗4°C 封闭过夜，PBS洗三遍，二抗37°C 孵育1 小时， PBS 洗三遍。用 DAPI 染细胞核观察新型冠状病毒在小鼠肺脏上的定位。新型冠状病毒一抗为病人恢复期血清，羊源抗人二抗用， FITC 标记。

（6）感染后第14天，分离血清，测定特异性IgG。

2.5 数据统计处理方法

所有的数据用GraphPad Prism 6.0 软件分析，感染组小鼠和其他对照组小鼠用T 检验方法分析差异，显著性差异用*p ﹤ 0.05, **p﹤0.01 或者 #p﹤0.05, ##p﹤0.01 表示。

构建可以模拟临床重型和危重型患者的动物模型，勾勒出新冠肺炎症状明显期水貂模型肺组织和肺外多组织脏器时相性动态变化病理全景图。与临床重症患者的报道一致，受感染的水貂病理损伤累及多个脏器，表现出多器官和系统的病变，伴有炎症反应显著增加，病毒在肺脏（图1）、心血管（图2）、肝胆（图3）、泌尿、内分泌（图4）、消化和免疫系统广泛分布。更重要地，血清的脂质组学和代谢组学分析表明，水貂在感染后6dpi的变化与临床重型和危重型COVID-19患者极为相似（图5），且这种变化与其组织病理学改变息息相关。特别是代谢途径改变，维生素、脂类、胆固醇、类固醇、氨基酸和蛋白质的消化和吸收异常，肝功能障碍等，表明机体代谢和免疫失调。在感染后水貂血清中，升高的犬尿氨酸促进了犬尿氨酸代谢通路的显著激活，并与巨噬细胞的激活有关，解释了病毒与激活的巨噬细胞在全身多脏器共定位的现象。另外，我们筛选出数种重要的代谢产物具有作为疾病治疗靶向分子和潜在生物标志物的可能（图6）。

与对照组相比，感染后第一天（1dpi）水貂肺组织即表现出急性炎症和间质增宽，在疾病发展过程中，4到6dpi病理损伤最严重，主要表现为重度间质性肺炎，肺泡间隔严重增宽，多个肺泡融合，肺泡上皮增生，肺泡腔内有弥漫的渗出液和炎性细胞渗出物以及脱落变性坏死的上皮细胞。对1-6dpi的肺组织病毒RNA检测时，每只动物都观察到病毒RNA，14天时仍然有2/3动物肺组织检测出少量病毒RNA。免疫组化检测结果与之一致，4-6dpi时肺组织内的病毒抗原最多。另外，4dpi时肺脏的渗出最为明显，14dpi可以观察到纤维结缔组织增生（图1）。

所有涉及的病毒实验操作全部在中国医学科学院医学实验动物研究所 ABSL 3 实验室完成，该实验室已经具备相关实验室和福利伦理资质。

该项研究系统分析了新冠肺炎症状明显期水貂病理改变和代谢紊乱的特征，建立了一个理想的新冠病毒感染重症动物模型，模拟了新冠病毒引起的机体系统和严重的病理改变特征。